4. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL
4.4. Mètodes analítics pel seguiment de la biomassa
El seguiment del creixement de la biomassa en el fermentador es fa mesurant la densitat òptica. Prèviament s’haurà obtingut la correlació de la densitat òptica i el contingut de proteína determinat pel mètode de Bradford tal i com s’explica a l’apartat 4.4.3.
4.4.1. Densitat òptica
Es basa en la mesura de la terbolesa que provoquen els microorganismes en el medi de cultiu. Es mesura l’absorbància en un espectrofotòmetre a 600 nm utilitzant com a blanc el medi de cultiu corresponent sense inocular. L’absorbància mesurada és proporcional a la quantitat de microorganismes.
Si el cultiu presenta una densitat òptica superior a 1 unitat, cal fer una dilució.
Material i equips:
- Espectofotòmetre (PerkinElmer model Lambda 25)
- Cubetes
- Medi de cultiu per fer blanc i dilucions
- Pipetes estèrils de 5 mL
4.4.2. Determinació de proteïna pel mètode de Bradford
El mètode de Bradford per a la determinació de proteïnes es basa en lús d’ un reactiu d’un colorant hidrofòbic (Blau de Coomasie G-250) que al interaccionar amb la proteïna origina un color blau intens que absorbeix a 595 nm.
El mètode requereix la preparació d’una recta de calibratge utilitzant una proteïna patró (albúmina bovina).
- 14 tubs d'assaig amb tap
- 1 micropipeta de 1mL
- 3 vasos de precipitats
- Un flascó amb tap de 100 mL
- 1 vidre de rellotge
- Puntes de micropipeta
- Matràs aforat de 100 mL
Equips:
- Espectrofotòmetre (PerkinElmer model Lambda 25)
- Balança
- Centrífuga (Selecta model angular 6)
- Bany termostàtic
Reactius:
- Aigua destil·lada
- Albúmina
- Reactiu de Bradford(Sigma referencia B6916)
- NaOH 1M
Procediment recta calibratge
- Solució mare: Es pesen 500 mg d’albúmina es dissolen en aigua destil·lada i s’enrasen en un matràs aforat de 100 mL. Es ròtula com a solució mare (5 mg albúmina/ml) i es guarda a la nevera.
- A partir de la solució mare es prepara una solució més diluïda ( 0,5 mL de solució mare + 4,5 mL de H2O destil·lada ) i es ròtula com a solució P (0,5 mg/mL ).
- Partint d’aquesta solució P es realitzen les següents dilucions:
- Es prepara una gradeta amb set tubs d’assaigs retolats del 1 al 5 i els 2 restants amb (B1) i (B2). A cadascun s’introdueixen 0.1 ml de les següents solucions i 3ml de reactiu de Bradford (tal i com es mostra a continuació):
Un cop addicionat el reactiu de Bradford cal deixar reposar durant 10 minuts a temperatura ambient i es procedeix a realitzar la seva lectura a l’espectrofotòmetre a 595nm.
Procediment anàlisi de mostres
- Es prenen 3 ml de cada mostra i es centrifugen durant 5minuts.
- Es prepara el bany a 100 ºC.
-
Es decanta el sobrenedant a l’interior d’un vas de precipitats amb hipoclorit sòdic, i s’addiciona a cada tub d’assaig 1 ml d’hidròxid de sodi 1M i s’agiten fins la
resuspensió total de les cel·lules i s’introdueixen al bany maria durant 5 minuts. - Es deixa refredar i 0,1 ml de cada mostra s’introdueixen dins d’un tub d’assaig i s’addicionen 3ml de reactiu de Bradford.
- Cal deixar reposar durant 10 minuts a temperatura ambient i es procedeix a realitzar la seva lectura a l’espectrofotòmetre a 595nm.
4.4.3. Comparació Densitat Òptica i mètode de Bradford
La relació directa entre densitat òptica i proteïna que s’obté graficant aquests dos paràmetres, permet fer el seguiment de la biomassa en els creixement en el fermentador emprant la mesura de la densitat òptica (mètode més ràpid i senzill) i mitjançant la recta de correlació obtenir el valor corresponent de proteïna cel·lular.
A continuació es mostra un exemple d’aquesta correlació obtinguda per E. coli:
